Panduan ini berisikan tata cara analisis kimia pada pakan, dari sampling / pengambilan contoh sampai perhitungan.

Table of contents

Pengantar

Produksi hewan yang optimal ditentukan oleh nutrisi hewan yang memadai dari sudut pandang fisiologis, ekonomis, dan ekologis. Untuk menyediakan nutrisi yang diperlukan hewan untuk memenuhi kebutuhan mereka untuk pemeliharaan, pertumbuhan, kehamilan dan produksi daging, susu, telur, wol, untuk mengurangi risiko kesehatan hewan dan untuk meminimalkan ekskresi dan emisi ke lingkungan, kesehatan hewan dan untuk meminimalkan ekskresi dan emisi ke lingkungan, nutrisi dari pakan yang digunakan dalam makanan harus diketahui dengan tepat. Sebagian besar pakan ternak seperti hijauan dan produk sampingan dari makanan manusia dan produksi bio-energi memiliki kualitas yang bervariasi, sehingga diperlukan analisis per batch. Karena kebutuhan nutrisi didapat dari analisis dengan metode standard, sangat penting bahwa kandungan nutrisi pakan dianalisis dengan metode standard yang sama atau serupa. Selain itu, penggunaan metode standard meningkatkan transparansi data di antara laboratorium, lembaga dan perusahaan.

Metode yang umum digunakan untuk menentukan bahan kimia dan komposisi mineral pakan. Uraian metode ini dimulai dengan prinsip, cakupan, peralatan, reagen, prosedur, perhitungan, serta acuan / referensi. Untuk peralatan dan reagen yang disebutkan hanya spesifik sesuai kebutuhan laboratorium. Prosedur ini dijelaskan dalam singkat, detail lebih lanjut dapat ditambahkan sesuai dengan fasilitas spesifik masing-masing laboratorium. Persiapan sampel tidak dijelaskan dalam prosedur. Selain itu, analisis duplikat direkomendasikan dan batas tertentu untuk mengevaluasi hasil pengujian juga dilakukan. Jika laboratorium tidak dapat mencapai batas-batas ini, reproduktifitas intralab spesifik harus ditentukan dan dikutip bila diminta. Berikut ini, latar belakang dan relevansi metode untuk menganalisis pakan akan dibahas.

Sejak Henneberg dan Stohmann mengembangkan skema analisis Weende pada tahun 1860, komponen kimia utama pakan ternak dianalisis menggunakan metode empiris yaitu kkadar air, protein kasar, serat kasar, lemak kasar dan kadar abu, sedangkan fraksi residu dari ekstraktif bebas nitrogen dihitung dengan selisih.

Pada tahun 1963, Van Soest mengembangkan skema analisis khusus yang bertujuan untuk karakterisasi pakan berdasarkan sifat dinding sel. Pada Tabel 1, kedua skema analisis ini diberikan bersama dengan konstituen kimianya.

Penentuan kadar air yang diikuti dengan penentuan kadar abu dalam pakan, menghasilkan kandungan bahan organik yang mengandung zat-zat nutrisi untuk hewan.

Protein kasar ditentukan sebagai nitrogen dan berasal dari protein asli, terutama asam amino dan peptida, dan non-protein seperti amonia, urea, nitrat, amina. yang pertama adalah blok bangunan langsung untuk pembentukan protein hewani; Nitrogen non protein (NPN) dengan adanya energi merangsang pertumbuhan bakteri rumen bakteri, sumber protein berkualitas tinggi untuk hewan.

Lemak kasar mengandung asam lemak, pigmen dan lilin; berguna sebagai penyimpanan energ juga bahan penyusun untuk pembentukan lemak hewani dan merupakan sumber vitamin.

Fraksi terbesar dalam pakan umumnya adalah karbohidrat, yang merupakan sumber energi, dan dengan bentuk / struktur sangat beragam di alam.

Serat kasar terdiri dari selulosa, polimer linier glukosa dan lignin, sebuah polimer dari asam fenolik. Neutral Detergent Fiber (NDF) mewakili total dinding sel: hemiselulosa, selulosa, dan lignin. Acid Detergent Fiber (ADF) mirip dengan serat kasar. Perbedaan antara NDF dan ADF adalah pengukuran hemiselulosa, yang merupakan polimer bercabang dari berbagai jenis gula yang berbeda. Perbedaan antara ADF dan lignin adalah pengukuran selulosa.

Hemiselulosa dan selulosa sebagian dapat dicerna oleh hewan pemamah biak (Ruminant), tetapi hampir tidak dapat dicerna untuk hewan monogastrik; daya cerna mereka terutama tergantung pada derajat lignifikasi. ADF mengandung nitrogen sebagai hasil dari denaturasi protein oleh pencoklatan enzimatik (reaksi Maillard). Pektin juga merupakan polisakarida matriks, tetapi sangat mudah dicerna. Di antara karbohidrat non-struktural, pati, fruktosa, dan gula merupakan komponen penting. Penentuan kandungan energi kasar pakan memberikan gambaran tentang nilai kalori pada pakan.

Hijauan yang dipanen dalam kondisi iklim yang baik, dapat disilase sebagai pakan musim dingin. Selama proses silase, gula difermentasi menjadi asam laktat dan asam asetat, beberapa etanol dan terkadang asam butirat. Karakterisasi dari produk fermentasi membantu mengevaluasi kualitas silase dan dapat digunakan untuk mengoreksi kandungan air dalam silase karena hilangnya zat-zat yang mudah menguap selama pengeringan oven.

Selain protein dan energi, hewan membutuhkan mineral. Kalsium dan fosfor adalah dua mineral yang sangat penting untuk perkembangan tulang hewan, tetapi jugauntuk produksi susu dan telur. Mineral penting lainnya adalah magnesium, natrium dan kalium. Karena sebagian besar tanaman tidak menyediakan natrium yang cukup untuk pakan hewan dan mungkin kekurangan kandungan klorida yang dibutuhkan, penambahan garam adalah bagian penting dari nutrisi diet seimbang untuk hewan. Elemen mikro sangat penting untuk reaksi enzimatik dalam tubuh seperti besi, tembaga, seng, mangan, kobalt, yodium dan selenium

Ruminansia dapat mencerna hijauan dan pakan yang kurang dapat dicerna seperti jerami dan dedak. Selain zat-zat nutrisi, pakan juga dapat mengandung zat-zat yang tidak diinginkan. Senyawa ini ada di dalam dan / atau pada produk yang ditujukan untuk pakan ternak dan yang berpotensi menimbulkan bahaya bagi kesehatan hewan, kesehatan manusia, lingkungan dan dapat mempengaruhi produksi ternak. Zat-zat tersebut adalah dioksin, polychlorinated biphenyls (PCB), logam berat, dan mikotoksin. Sebagai kontaminan yang tidak mungkin untuk sepenuhnya menghilangkan keberadaannya tetapi harus dikurangi karena dapat menyebabkan toksisitas akut, bioakumulabilitas dan degradabilitas zat, untuk mencegah efek yang tidak diinginkan dan berbahaya.

Table 1.

Di hampir semua negara memiliki peraturan tentang tingkat maksimum untuk zat-zat yang tidak diinginkan. Jika ini melewati ambang batas, maka dilarang mengimpor produk dan memberi pakan. Oleh karena itu, analisis yang akurat sangat penting untuk zat-zat ini. Karena itu metode pengujian mikotoksin (aflatoksin, fumonisin, deoksinivalenol dan zearalenon) juga dijelaskan

Metode Analisis Kimia Pangan dan Pakan

Metode Analisis Proksimat / Proximate Analysis

Air / Moisture Content

Prinsip Pengujian

Bahan kering atau kadar air ditentukan secara gravimetri sebagai residu yang tersisa setelah dikeringkan pada suhu 135 ºC selama 2 jam dalam oven berventilasi.

Cakupan Pengujian

Prosedur ini dapat diterapkan untuk penentuan bahan kering atau kadar air dalam bahan pakan, pakan dan hijauan yang dikeringkan sebagian (85% bahan kering) dengan kandungan asam volatil yang rendah.

Peralatan

1. Cawan aluminium.
2. Neraca elektronik analitik, akurat hingga 0,1 mg.
3. Oven pengering udara paksa pada suhu 135 ± 2 °C. Oven harus dilengkapi dengan rak untuk memungkinkan sirkulasi udara.
4. Desikator.

Reagen

Tidak ada.

Prosedur

1. Keringkan cawan aluminium dengan penutup pada suhu 135 ± 2 °C selama minimal 1 jam.
2. Pindahkan ke Desikator.
3. Segera tutup Desikator dan biarkan cawan mendingin hingga mencapai suhu kamar.
4. Keluarkan cawan satu per satu dari Desikator, timbang cawan (W1) hingga ketelitian 0,1 mg,
5. Tambahkan sekitar 2 g sampel ke dalam setiap cawan. Catat berat cawan dan sampel (W2) ke 0,1 mg terdekat.
6. Masukkan cawan sampel ke dalam oven yang telah dipanaskan pada suhu 135 ± 2 °C dan keringkan setidaknya selama 2 jam, mulai waktu setelah oven mencapai suhu hingga berat konstan, mungkin perlu memeriksa ini untuk berbagai jenis sampel, setelah dikonfirmasi gunakan waktu pengeringan tersebut
7. Pindahkan sampel ke desikator, tutup desikator dan biarkan dingin hingga mencapai suhu ruangan.
8. Timbang cawan dan sampel kering (W3), catat bobot ke 0,1 mg terdekat

Perhitungan

Persen Bahan Kering atau Kadar air (% Air):

$Kadar Air (\%) = \frac{(W3 - W1)}{(W2 - W1)} x 100\%$

dimana
W1 = berat cawan kosong (g)
W2 = berat cawan dan sampel (g)
W3 = berat cawan dan sampel setelah dikeringkan (g).

Hal-hal yang perlu diperhatikan

1. Tutup Desikator harus digeser perlahan untuk mengeluarkan setiap wadah dan ditutup kembali selama penimbangan. Membiarkan tutupnya terbuka memungkinkan sampel menyerap kelembapan dari udara.
2. Wadah sampel tidak boleh diletakkan terlalu rapat di dalam Desikator. Dibutuhkan ruang untuk pergerakan udara dalam mendinginkan cawan sampel. Buka Desikator yang dimuat dengan sangat lambat setelah sampel dingin. Kondisi vacuum udara terbentuk selama pendinginan dan pembukaan yang tiba-tiba mengakibatkan turbulensi yang dapat meniup sampel keluar dari wadah yang tidak tertutup.
3. Desiccant harus diperiksa dan dikeringkan secara berkala. Gunakan Desiccant dengan warna dengan indikator warna.
4. Selalu gunakan penjepit(tong) untuk memegang wadah.

Acuan / Daftar Pustaka

AOAC 930.15. 2000. Moisture in animal feed, loss on drying at 135 °C for 2 hours. Gaithersburg, MD, USA.
ISO 6496. 1999. Animal feeding stuffs – Determination of moisture and other volatile matter content. Geneva, Switzerland.
Commission Regulation (EC) No 152/2009. 27 Jan 2009. Laying down the methods of sampling and analysis for the official control of feed. Annex III, A Official Journal of the European Union L54/1 from 26/02/2009.

Abu / Ash Content

Prinsip Pengujian

Abu ditentukan secara gravimetri sebagai residu setelah pengabuan pada suhu 600 °C.

Cakupan Pengujian

Metode ini dapat diterapkan untuk penentuan abu dalam bahan pakan dan pakan. Metode ini tidak dapat digunakan untuk campuran mineral.

Peralatan

1. Cawan keramik untuk pengabuan.
2. Neraca elektronik analitik, ketelitian hingga 0,1 mg.
3. Tanur, mampu mempertahankan suhu hingga 600 ± 20 °C.
4. Desikator.

Reagen

Tidak ada.

Prosedur

1. Keringkan cawan pembakaran pada suhu 550°C selama minimal 1 jam, keluarkan dari Tanur dan dinginkan perlahan.
2. Timbang cawan kosong (W1).
3. Tambahkan sekitar 2 g sampel ke dalam cawan (W2).
4. Tempatkan cawan di dalam muffle furnace yang telah dipanaskan pada suhu 600 ± 20 °C selama 2 jam.
5. Setelah pengabuan, dinginkan cawan secara perlahan.
6. Pindahkan cawan ke dalam Desikator dan biarkan dingin hingga mencapai suhu ruangan.
7. Timbang cawan (W3).

Perhitungan

Persen Kadar Abu (%):

$Kadar Abu (\%) = \frac{(W3 - W1)}{(W2 - W1)} x 100\%$

dimana
W1 = berat cawan kosong (g)
W2 = berat cawan dan sampel (g)
W3 = berat cawan dan sampel setelah dikeringkan (g).

Hal-hal yang perlu diperhatikan

1. Hati-hati saat membuka pengering untuk menghindari hilangnya abu karena terbawa udara.
2. Dessicant harus dijaga agar tetap segar dan penutup Desikator diberi pelumas (vaseline gel) agar bisa ditutup dengan benar.
3. Tare ulang Timbangan setiap melakukan penimbangan.

Acuan / Daftar Pustaka

AOAC 942.05. 2000. Ash of animal feed. Gaithersburg, MD, USA. ISO 5984. 2002. Animal feeding stuffs – Determination of crude ash. Geneva, Switzerland.
Commission Regulation (EC) No 152/2009. 27 Jan 2009. Laying down the methods of sampling and analysis for the official control of feed. Annex III, M, Official Journal of the European Union L54/1 from 26/02/2009.

Protein Kasar / Crude Protein

Prinsip Pengujian

Untuk penentuan nitrogen, sampel dilumat menggunakan asam sulfat dengan bantuan katalis untuk mengubah nitrogen sampel menjadi ammonium sulfat. Larutan asam dijadikan basa dengan larutan natrium hidroksida. Ammonia hasil reaksi didistilasi dan dikumpulkan larutan asam borat berlebih, diikuti dengan titrasi dengan larutan asam klorida. Untuk penentuan nitrogen protein kasar dikalikan dengan suatu faktor (6,25)

Cakupan Pengujian

Metode ini dapat diterapkan untuk penentuan nitrogen dalam pakan.

Peralatan

1. Neraca analitik, akurat hingga 0,1 mg.
2. Tabung Digestion yang dipasang pada unit Digestion Kjeldahl.
3. Unit Digestion Kjeldahl dengan manifold penyerap asap.
4. Peralatan distilasi Kjeldahl.
5. Buret untuk titrasi

Reagen

1. Asam sulfat, pekat, 95-98% (b/v)
2. Tablet katalis Kjeldahl
3. Asam borat, 40 g/liter.
4. Larutan NaOH, 40% (b/v).
5. Larutan indikator: Indikator metil merah, larutkan 1 g metil merah dalam 100 ml metanol atau etanol.
6. Larutan volumetrik standard asam klorida, c = 0,1 M (akurat hingga 0,1000 M).

Prosedur

1. Pelumatan / Digestion

• Timbang sekitar 0,5 g sampel (W) dan pindahkan ke tabung digestion. Dalam setiap batch, gunakan satu tabung tanpa sampel sebagai blanko uji.
• Tambahkan dua tablet katalis Kjeldahl dan 15 ml asam sulfat.
• Tempatkan tabung-tabung tersebut di dalam unit digestion dan sambungkan ke saluran penghilang asap.
• Lumat sampel setidaknya 1 jam pada suhu 420 ± 20 °C.
• Setelah selesai, matikan alat dan biarkan dingin.

2. Distilasi dan Titrasi Prosedur berikut ini menjelaskan metode distilasi dan titrasi manual. Jika menggunakan unit distilasi dan titrasi otomatis, ikuti petunjuk dari produsen.

• Tambahkan air suling ke setiap tabung hingga volume total sekitar 80 ml
• Tempatkan erlenmeyer yang berisi 25-30 ml asam borat pekat di bawah saluran keluar kondensor unit distilasi sedemikian rupa sehingga tabung aliran terendam larutan asam borat.
• Tambahkan 50 ml NaOH dan distilasi amonium dengan mengikuti petunjuk dari pabrikan.
• Titrasi larutan dalam erlenmeyer dengan larutan asam klorida terstandardisasi setelah menambahkan beberapa tetes larutan indikator menggunakan buret dan baca jumlah titran yang digunakan. Titik akhir tercapai saat muncul warna merah muda pada larutan.
• Catat jumlah titer asam yang digunakan.

Perhitungan

Persen Nitrogen (% N)

$Kadar Nitrogen (\%) = \frac{(Vs - Vb) x M (HCl) x 1 x 14,007}{(W x 10)} x 100\%$

dimana
Vs = ml HCl yang diperlukan untuk mentitrasi sampe
Vb = ml HCl yang dibutuhkan untuk uji blanko
M (HCl) = molaritas HCl
1 = faktor asam
14,007 = berat molekul Nitrogen
10 = konversi dari mg/g ke %
W = berat sampel (g)\

Perhitungan persen Protein Kasar (% PK):

$\% PK = \% N x F$

dimana
F = 6,25 untuk semua hijauan, pakan dan pakan campuran
F = 5,70 untuk biji-bijian gandum
F = 6,38 untuk susu dan produk susu.

Hal-hal yang perlu diperhatikan

1. Faktor konversi internasional (F) didasarkan pada komposisi rata-rata asam amino asam amino dalam protein dalam bahan pakan. Oleh karena itu, faktor yang sebenarnya dapat bervariasi antar bahan pakan.
2. Jika asam sulfat digunakan untuk titrasi, faktor asam yang digunakan harus 2.
3. Katalis juga dapat dibuat di laboratorium. Katalis tersebut harus mengandung 3,5 g kalium sulfat dan 0,4 g tembaga (II) sulfat pentahidrat.

Acuan / Daftar Pustaka

AOAC 984.13. 2000. Protein (crude) in animal feed and pet food, copper catalyst Kjeldahl method. Gaithersburg, MD, USA.
AOAC 988.05. 2000. Protein (crude) in animal feed and pet food: CuSO4/TiO2 mixed catalyst Kjeldahl method. Gaithersburg, MD, USA. AOCS Ba4d-90. Nitrogen-ammonia-protein modified Kjeldahl method, titanium dioxide + copper sulphate catalyst. Gaithersburg, MD, USA.
ISO 5983-2. 2009. Animal feeding stuffs – Determination of nitrogen content and calculation of crude protein content – Part 2: block digestion/steam distillation method. Geneve, Switzerland.
Commission Regulation (EC) No 152/2009. 27 Jan 2009. Laying down the methods of sampling and analysis for the official control of feed. Annex III, C, Official Journal of the European Union L54/1 from 26/02/2009.

Lemak Kasar / Crude Fat

Prinsip Pengujian

Lemak diekstraksi dari sampel menggunakan pelarut non-polar (seperti n-hexane). Pelarut didistilasi dan residu dikeringkan lalu ditimbang.

Lemak dapat diukur dengan atau tanpa hidrolisis sebelumnya. Penggunaan hidrolisis sebelumnya sebagian besar menghasilkan hasil yang lebih tinggi, terutama untuk pakan yang diberi perlakuan panas dan pakan yang berasal dari hewan.

Cakupan Pengujian

Penentuan lemak dapat digunakan untuk pakan dan bahan pakan sebanyak 2 gram untuk sampel kandungan lemak kasar lebih rendah dari 20%, dan 1 gram untuk sampel kandungan lemak kasar diatas 20%.

Peralatan

1. Neraca analitik, ketelitian hingga 0,1 mg.
2. Alat pemanas dengan pengatur suhu.
3. Thimble ekstraksi, bebas dari lemak.
4. Unit refluks.
5. Ekstraktor tipe Soxhlet.
6. Oven.
7. Desikator.

Reagen

1. n-hexane

Prosedur

1. Timbang sedikitnya 2 g sampel (W1) ke dalam Thimble ekstraksi dan tutup dengan gumpalan kapas bebas lemak.
2. Ekstrak selama 40 menit dengan n-hexane dan atur alat pemanas

Perhitungan

Hal-hal yang perlu diperhatikan:

1. Metode gravimetri lemak kasar bisa digunakan evaluasi analisis kadar gross energy.
2. Hindari uap pelarut lemak.
3. Buka wadah (wadah reagen dan gelas kimia) di dalam lemari asam.
4. Lakukan ekstraksi di tempat yang berventilasi baik.

Acuan / Daftar Pustaka

AOAC 920.39. 2000. Fat (crude) or ether extract in animal feed. Gaithersburg, MD, USA.
ISO 6492. 1999. Animal feeding stuffs – Determination of fat content. Geneva, Switzerland.
Commission Regulation (EC) No 152/2009. 27 Jan 2009. Laying down the methods of sampling and analysis for the official control of feed. Annex III, H, Official Journal of the European Union L54/1 from 26/02/2009.

Serat Kasar / Crude Fibre

Prinsip Pengujian

Sampel yang telah diekstraksi lemaknya secara berurutan diberi perlakukan dengan asam sulfat encer mendidih dan larutan kalium hidroksida mendidih. Hilangnya massa yang dihasilkan dari pengabuan sesuai dengan massa serat kasar.

Cakupan Pengujian

Metode dapat digunakan untuk penentuan pakan dengan kandungan serat kasar lebih tinggi dari 1%. Jika sampel mengandung >10% lemak, ekstrak lemak dengan pelarut non-polar atau semi-polar sebelum memulai analisis.

Peralatan

1. Neraca analitik, ketelitian hingga 0,1 mg.
2. Crucible saringan kaca, P100.
3. Alat pemanas.
4. Peralatan filtrasi, yang terhubung ke sistem vakum, misalnya sistem Fibertec.
5. Desikator.
6. Oven pengering berventilasi, yang mampu dipertahankan pada suhu 135 ± 2 °C.
7. Tanur, yang mampu dipertahankan pada suhu 600 ± 20 °C.

Reagen

1. Asam sulfat, 0,15 M.
2. Aseton (spesifikasi / kualitas teknis).
3. Kalium hidroksida, 0,23 M.

Prosedur

1. Perlakuan awal

• Untuk setiap Crucible P100, timbang 1 g sampel (W1).
• Tempatkan Crucible pada peralatan filtrasi dan tambahkan sekitar 25 ml pelarut ke dalam masing-masing wadah dan saring menggunakan vakum.
• Ulangi pencucian sebanyak dua kali.
• Keringkan residu di udara

2. Pelumatan (Digestion)

• Tambahkan ke dalam setiap gelas kimia 150 ml asam sulfat dan didihkan selama 30 ± 1 menit. Jika muncul busa, tambahkan beberapa tetes zat anti-berbusa (anti-foam).
• Saring larutan melalui wadah dengan menggunakan vakum.
• Cuci residu dengan air suling panas.
• Tambahkan sedikit aseton untuk merendam residu. Buang aseton setelah beberapa menit dengan memberikan sedikit isapan vakum.
• Tambahkan ke setiap gelas kimia 150 ml kalium hidroksida dan didihkan selama 30 ± 1 menit.
• Saring larutan melalui wadah dengan menggunakan vakum.
• Cuci residu dengan air suling panas sampai pembilasan netral.
• Cuci residu sebanyak 3 kali di bawah vakum, masing-masing dengan 25 ml aseton. Keringkan residu dengan cara diisap setiap kali selesai pencucian.

3. Pengeringan dan Pengabuan

• Masukkan Crucible ke dalam oven yang diatur pada suhu 135 ± 2 °C dan keringkan selama 1 jam. Waktu pengeringan dimulai ketika oven telah mencapai 135 °C.
• Letakkan Crucible di dalam desikator dan biarkan dingin.
• Timbang wadah secara langsung setelah dikeluarkan dari desikator ke 0,1 mg (W2).
• Tempatkan Crucible dalam Tanur, dan bakar sampel selama 2 jam pada suhu 525 ± 20 °C. Waktu pembakaran dimulai ketika tungku telah mencapai 525 ° C.
• Biarkan Crucible dingin perlahan didalam Tanur, setelah dingin tempatkan Crucible dalam desikator dan biarkan dingin. Timbang wadah (W3)

Perhitungan

Persen Serat Kasar (%):

$Kadar Serat Kasar (\%) = \frac{(W2 - W3)}{(W1)} x 100\%$

dimana
W1 = berat sampel (g)
W2 = berat wadah dan residu setelah pengeringan (g)
W3 = berat wadah dan residu setelah pembakaran (g).

Hal-hal yang perlu diperhatikan

1. Untuk penetapan kadar serat kasar, terdapat metode lain yang tersedia yang dapat digunakan pencucian kantong (filter bag) secara otomatis. Untuk melakukan metode ini ikuti petunjuk dari produsen alat. Penggunaan metode-metode ini dapat menyebabkan hasil yang berbeda dibandingkan dengan hasil yang didapat menggunakan metode filtrasi.

Acuan / Daftar Pustaka

ISO 6865. 2000. Animal feeding stuffs – Determination of crude fibre content – Method with intermediate filtration. Geneva, Switzerland.
Commission Regulation (EC) No 152/2009. 27 Jan 2009. Laying down the methods of sampling and analysis for the official control of feed. Annex III, I, Official Journal of the European Union L54/1 from 26/02/2009.

Neutral Detergent Fibre (NDF)

Prinsip Pengujian

Sampel setelah dihilangkan lemaknya direbus dengan reagen diikuti dengan perlakuan dengan α-amilase dalam larutan penyangga / buffer untuk melarutkan pati yang tersisa. Bobot hilang setelah pengabuan residu kering berbanding lurus dengan kadar NDF

Cakupan Pengujian

Metode ini dapat diterapkan untuk penentuan pakan dengan kandungan NDF yang lebih tinggi dari 1%

Peralatan

1. Neraca analitik, ketelitian hingga 0,1 mg.
2. Crucible saringan kaca, P100 atau yang setara.
3. Alat pemanas.
4. Peralatan filtrasi, yang terhubung ke sistem vakum, misalnya sistem Fibertec.
5. Desikator.
6. Oven pengering berventilasi, yang mampu dipertahankan pada suhu 135 ± 2 °C.
7. Tanur, yang mampu mempertahankana suhu 600 ± 20 °C

Reagen

1. Kualitas teknis aseton.
2. Neutral Detergent Solution (NDS), yang mengandung 1 liter air suling: 30 g Sodium-lauril sulfat (=dodecyl-Na-sulfat) 6,81 g Natrium tetra borat Na2B4O7.10H2O. 4,56 g di-Sodium hidrogen fosfat Na2HPO4 atau 5,72 g Na2HPO4.H2O 18,61 g Asam etilen diamin tetra asetat, garam di-natrium. 10 ml 2-etoksi-etanol Sesuaikan pH larutan menjadi 6,9-7,1 dengan menggunakan natrium hidroksida atau asam klorida.
3. Larutan amilase. Larutkan 2,5 mg amilase tahan panas dalam 60,6 ml 0,1 M disodium hidrogen fosfat (Na2HPO4) dan 39,2 ml 0,1 M kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4)

Prosedur

1. Perlakuan awal

   • Timbang masing-masing wadah P100.
   • Timbang 0,5 g sampel hingga ketelitian 0,1 mg (W1) dalam wadah.
   • Tempatkan krusibel pada peralatan filtrasi dan tambahkan sekitar 25 ml aseton ke setiap krusibel dan saring menggunakan vakum.
   • Ulangi pencucian sebanyak dua kali.
   • Keringkan residu di udara dan pindahkan secara kuantitatif ke gelas kimia

2. Pencernaan

   • Tambahkan 50 ml NDS ke dalam setiap wadah dan didihkan selama 60 ± 1 menit dengan refluks, jika terjadi pembusaan, tambahkan beberapa tetes zat anti busa.
   • Saring campuran melalui wadah dengan menggunakan vakum
   • Cuci residu dua kali, masing-masing dengan 10 ml air suling panas.
   • Tambahkan volume aseton untuk membersihkan residu. Buang aseton setelah beberapa menit dengan memberikan sedikit vakum.
   • Pindahkan residu secara kuantitatif ke dalam gelas kimia
   • Tambahkan ke dalam setiap gelas kimia 1-2 ml larutan α-amilase dan kemudian 30 ml air suling mendidih. Diamkan selama 5-10 menit.
   • Pindahkan larutan ke dalam wadah dan cuci dua kali dengan air suling panas dan dua kali dengan aseton sampai bersih. Keringkan residu dengan cara divakum setiap kali selesai pencucian.

3. Pengeringan dan pembakaran

   • Tempatkan crucible dalam oven yang diatur pada suhu 135 ± 2 °C dan keringkan selama setidaknya 2 jam. Waktu pengeringan dimulai ketika oven telah mencapai 135 °C
   • Tempatkan crucible dalam desikator dan biarkan dingin.
   • Timbang wadah secara langsung setelah dikeluarkan dari desikator ke timbangan (W2). Tempatkan crucible dalam muffle furnace (4.7), dan bakar selama 3 jam pada suhu 525 °C ± 20 °C. Waktu pembakaran dimulai ketika tungku telah mencapai 525 °C.
   • Letakkan crucible setelah pengabuan dalam desikator dan biarkan dingin.
   • Timbang wadah secara langsung setelah dikeluarkan dari desikator ke timbangan (W3).

Perhitungan

Persen NDF (%NDF): $Kadar NDF (\%) = \frac{(W2 - W3)}{(W1)} x 100\%$

dimana
W1 = berat sampel (g)
W2 = berat wadah dan residu setelah pengeringan (g)
W3 = berat wadah dan residu setelah pembakaran (g).

Hal-hal yang perlu diperhatikan

1. Untuk penentuan NDF, ada juga metode yang menerapkan pencucian otomatis kantong / filter bag. Untuk melakukan metode-metode ini, ikuti petunjuk dari produsen. Penggunaan metode ini dapat menunjukkan hasil yang berbeda dibandingkan dengan metode penyaringan / filtrasi.
2. Inkubasi tambahan dengan protease dapat digunakan untuk menghilangkan sisa-sisa protein yang tidak larut dalam residu.
3. Karena perlakuan dengan α-amilase dalam larutan penyangga / buffer untuk melarutkan pati yang tersisa, fraksi serat juga disebut sebagai ‘aNDF’. Penggunaan α-amilase dapat dihilangkan jika sampel (misalnya rumput dan jerami) tidak banyak kandungan pati.

Acuan / Daftar Pustaka

Robertson, j.b. & Van Soest, P.j. 1981.The detergent system of analysis and its application to human foods, In The Analysis of Dietary Fibre in Food. Vol 3. Chapter 8, (W.P.T. James and O Theander, eds.), Marcel Dekker, Inc.: New York.
Van Soest, P.j. & robertson, j.b. 1985. Analysis of forage and fibrous foods. A Laboratory Manual for Animal Science 613. Cornell University, Ithaca, New York, USA.

Acid Detergent Fiber (ADF) and Lignin (ADL)

Prinsip Pengujian

Sampel setelah dihilangkan lemaknya direbus dengan larutan deterjen asam. Penurunan bobot yang dihasilkan dari pengabuan residu kering berbanding lurus dengan kadar ADF. Untuk penentuan ADL, perebusan tambahan dengan asam sulfat pekat harus dilakukan sebelum mengukur bobot yang hilang hasil dari pengabuan residu kering

Cakupan Pengujian

Metode dapat diterapkan untuk penentuan pakan dengan kandungan ADF atau ADL lebih tinggi dari 1%.

Peralatan

1. Neraca analitik, ketelitian hingga 0,1 mg.
2. Crucible saringan kaca, P100 atau yang setara.
3. Alat pemanas.
4. Peralatan filtrasi, yang terhubung ke sistem vakum, misalnya sistem Fibertec.
5. Desikator.
6. Oven pengering berventilasi, yang mampu dipertahankan pada suhu 135 ± 2 °C.
7. Tanur, yang mampu mempertahankana suhu 600 ± 20 °C

Reagen

1. Aseton kualitas teknis.
2. Larutan deterjen asam (ADS), yang mengandung 20 g setil trimetilamonium bromida dalam 1 liter asam sulfat 0,5 M.
3. Asam sulfat 72% (w/w)

Prosedur

1. Perlakuan awal

   • Timbang wadah kosong.
   • Timbang 1 g sampel (W1) ke dalam wadah.
   • Tempatkan cawan dalam peralatan filtrasi dan tambahkan sekitar 25 ml aseton ke setiap wadah dan saring menggunakan vakum.
   • Ulangi pencucian sebanyak dua kali.
   • Keringkan residu dengan udara.

2. Pelumatan (ADF)

   • Tambahkan ke dalam setiap cawan 50 ml ADS dan didihkan selama 30 ± 1 menit sambil refluks. Jika muncul busa, tambahkan beberapa tetes zat anti busa.
   • Saring campuran melalui wadah dengan menggunakan vakum.
   • Cuci residu dua kali, masing-masing dengan 10 ml air suling panas.
   • Tambahkan sedikit aseton untuk merendam residu. Buang aseton setelah beberapa menit dengan memberikan sedikit vakum

3. Pengeringan pertama

   • Tempatkan cawan lebur dalam oven yang diatur pada suhu 135 ± 2 °C dan keringkan setidaknya selama 2 jam. Waktu pengeringan dimulai ketika oven telah mencapai 135 °C.
   • Tempatkan cawan dalam desikator dan biarkan dingin.
   • Timbang wadah secara langsung setelah dikeluarkan dari desikator ke timbangan (W2).

4. Pelumatan (ADL).
   CATATAN: Gunakan kacamata dan sarung tangan pengaman saat bekerja dengan asam sulfat 72%.

   • Tambahkan 10 ml asam sulfat 72% (5.3) ke dalam setiap wadah dan aduk dengan hati-hati batang kaca untuk memecah semua gumpalan.
   • Isi cawan setengah penuh dengan asam dan aduk setiap 30 menit.
   • Setelah 3 jam, saring sebanyak mungkin asam dengan vakum dan cuci isi dengan air suling panas sampai bebas dari asam.

5. Pengeringan

   • Tempatkan cawan dalam oven yang diatur pada suhu 135 ± 2 °C dan keringkan setidaknya selama 4 jam. Waktu pengeringan dimulai ketika oven telah mencapai 135 °C.
   • Tempatkan cawan dalam desikator dan biarkan dingin.
   • Timbang wadah secara langsung setelah dikeluarkan dari desikator ke timbangan (W3).

6. Pengabuan

   • Tempatkan cawan di dalam tanur, dan bakar sampel selama 2 jam pada suhu 525 °C ± 20 °C. Waktu pembakaran dimulai ketika tungku telah mencapai 525 ° C.
   • Tempatkan cawan lebur dalam desikator dan biarkan dingin.
   • Timbang wadah secara langsung setelah dikeluarkan dari desikator ke timbangan (W4).

Perhitungan

Persen ADF (% ADF): $Kadar ADF (\%) = \frac{(W2 - W4)}{(W1)} x 100\%$

Persen ADL (% ADL) $Kadar ADL (\%) = \frac{(W3 - W4)}{(W1)} x 100\%$

dimana
W1 = berat sampel (g)
W2 = berat wadah dan residu setelah pengeringan pertama (g)
W3 = berat wadah dan residu setelah pengeringan kedua (g)
W4 = berat wadah dan residu setelah pembakaran (g).

Hal-hal yang perlu diperhatikan

9.1 Untuk penentuan ADF, tersedia juga metode yang menerapkan pencucian kantong / filter bag secara otomatis. Untuk melakukan metode ini, ikuti petunjuk dari produsen. Penggunaan metode ini dapat memberikan hasil yang berbeda dibandingkan dengan yang didapat dengan metode penyaringan / filtrasi. 9.2 Inkubasi tambahan dengan amilase dapat digunakan untuk menghilangkan sisa-sisa yang tidak larut pati dalam residu. 9.3 Berhati-hatilah agar tidak merusak glass frit dalam wadah saat menggunakan batang pengaduk

Acuan / Daftar Pustaka

AOAC 973.18. 2010. Fiber (acid detergent) and lignin (H2SO4) in animal feed. Gaithersburg, MD, USA.
robertson, j.b. & Van Soest, P.j. 1981. The detergent system of analysis and its application to human foods, In The Analysis of Dietary Fibre in Food, Vol 3. Chapter 8, (W.P.T. James and O. Theander, eds.). Marcel Dekker, Inc.: New York.
Van Soest, P.j. & robertson, j.b. 1985. Analysis of forage and fibrous foods. In A Laboratory Manual for Animal Science 613. Cornell University, Ithaca, New York, USA.

Gross Energy / Gross Calorific Value

Prinsip Pengujian

Energi diukur dengan pembakaran sampel pada kondisi oksigen berlebih dalam bom kalorimeter. Nilai kalor dihitung dari kenaikan suhu air dalam bejana kalorimeter dan kapasitas panas efektif rata-rata dari kalorimeter.

Cakupan Pengujian

Metode ini dapat diterapkan pada semua jenis pakan.

Peralatan

1. Timbangan analitik, ketelitian hingga 0,1 mg.
2. Bom kalorimeter otomatis (metode ini untuk alat Parr 6400).
3. Unit pengisian oksigen.
4. Tangki Air

Reagen

5.1 Benang pembakaran. 5.2 Kawat platinum. 5.3 Asam benzoat (tablet pembakaran).

Prosedur

Pengukuran sampel

1. Timbang kira-kira 0,5-1,5 g sampel hingga 0,1 mg (W) dan letakkan di dalam cawan pembakaran.
2. Pasang kawat platina 10 cm di antara elektroda bom dan pasang wadah pembakaran dengan sampel pada tempatnya di elektroda lingkaran.
3. Ikat benang katun bakar di bagian tengah kawat. Sesuaikan benang sehingga menyentuh sampel.
4. Pasang bom, kencangkan tutup sekrup, tutup katup pelepas tekanan dan isi dengan oksigen hingga 25-30 atmosfer / 368 - 440 psi .
5. Tutup penutup dan nyalakan motor sirkulasi air.
6. Sesuaikan suhu air di jaket luar hingga kurang lebih sama kalorimeter dengan menambahkan air panas atau dingin dan biarkan 1 menit mencapai kesetimbangan.
7. Isi data sampel (nama, bobot) lalu mulai pembakaran, diamkan sampai selesai.
8. Cetak hasil uji, buka penutup kalorimeter, bersihkan cawan sampel.

Perhitungan

1. Rumus yang digunakan untuk menghitung ekuivalen hidrotermal (He) dari bom adalah:

$He = \frac{(W x A - (L x C) - 14)}{(Tf - Ti)}$

dimana
He = ekuivalen hidrotermal (J/˚C)
W = berat sampel asam benzoat (g)
A = joule per gram asam benzoat, yaitu 26442 J/g
L = berat benang katun (g)
C = joule per g kapas, yaitu 17500 J/g
14 = koreksi untuk pembentukan asam (J)
Tf = suhu akhir
Ti = suhu awal.

Untuk benang bakar, nilai yang diberikan oleh produsen dapat digunakan. Koreksi untuk pembakaran kawat platina sangat kecil dan dapat diabaikan. Nilai untuk pembentukan asam juga kecil dan ditetapkan sebesar 14 J.

2. Rumus yang digunakan untuk perhitungan kandungan energi kotor (GE) sampel adalah:

$GE (kJ/g) = \frac{(Tf - Ti) x He}{(W)}$

dimana
Tf = suhu akhir (˚C)
Ti = suhu awal (˚C)
W = berat sampel (g)
He = ekuivalen hidrotermal (J/˚C)
hasilnya perhitungan bisa dalam kJ/g, J/g atau cal/g.

Hal-hal yang perlu diperhatikan

1. Variasi dalam pembentukan asam hanya memiliki efek yang sangat kecil pada nilai yang ditemukan. Oleh karena itu, sebagian besar laboratorium menggunakan nilai tetap (yaitu 14 J) untuk koreksi asam.

Acuan / Daftar Pustaka

Hill, W.H., Seals, J., and Montiegel, E. 1958. Destruction of animal and vegetable tissue by combustion in a Parr oxygen bomb. Am. Ind. Hyg. J. 19: 378–81. ISO 9831. 1998. Animal feeding stuffs, animal products, and faeces or urine – Determination of gross calorific value – Bomb calorimeter method. Geneva, Switzerland. Parr Manual 744M. 2022. 6400 Automatic Isoperibol Calorimeter Instruction Manual. Parr Instrument Company, Moline, IL, USA.

Metode Analisis Mineral

Multi Elemen Logam - Metode Spektrofotometer Serapan Atom (SSA) / Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS)

Prinsip Pengujian

Bahan pakan diabukan dalam tanur, abu yang dihasilkan dilarutkan dalam asam klorida. Setelah penyaringan dan pengenceran yang sesuai, elemen logam dibaca oleh spektrofotometer serapan atom.

Cakupan Pengujian

Metode ini dapat diterapkan untuk penentuan kalsium (Ca), tembaga (Cu), besi (Fe), magnesium (Mg), mangan (Mn), kalium (K), natrium (Na) dan seng (Zn) dalam semua bahan pakan ternak.

Peralatan

1. Neraca analitik, ketelitian hingga 0,1 mg.
2. Tanur, mampu mempertahankan pada suhu 600 ± 20 ° C.
3. Hot Plate.
4. Spektrofotometer Serapan Atom (SSA) / Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS).
5. Peralatan gelas / Glassware.

Reagen

1. Asam klorida, c = 12 M.
2. Asam klorida, c = 6 M.
3. Asam klorida, c = 0,6 M.
4. Larutan lantanum nitrat Larutkan 133 g La(NO3)3.6 H2O dalam 1 liter air deionisasi
5. Larutan sesium klorida Larutkan 100 g CsCl dalam 1 liter air deionisasi
6. Larutan induk Cu, Fe, Mn, dan Zn Campurkan 100 ml air deionisasi dan 125 ml asam klorida (12 M) dalam labu ukur 1 L. volumetrik 1 L. Timbang bahan-bahan berikut ini: 392,9 mg tembaga (II) sulfat pentahidrat, CuSO4.5H2O 702,2 mg amonium besi (II) sulfat heksahidrat, (NH4)2SO4.FeSO4.6H2O 307,7 mg mangan sulfat monohidrat, MnSO4.H2O 439,8 mg seng sulfat heptahidrat, ZnSO4.7H2O Masukkan garam logam yang telah ditimbang ke dalam labu ukur dan larutkan. Encerkan sampai tanda tera dengan air deionisasi.
7. Larutan standar Cu, Fe, Mn, dan Zn Encerkan 20 ml larutan stok dengan air terdeionisasi dalam labu ukur 1 L dan encerkan sampai tanda tera dengan air deionisasi.
8. Larutan standar Ca, K, Mg, dan Na Encerkan 25 ml larutan stok dengan asam klorida encerhingga 250 ml dalam labu ukur. Kandungan Ca, K dan Na masing-masing 100 μg/ml, kandungan Mg adalah 20 μg/ml. Siapkan larutan yang masih baru untuk minggu penggunaan dan simpan dalam botol polietilen.
9. Larutan kosong lantanum-kaesium Tambahkan 5 ml larutan lantanum nitrat, 5 ml larutan caesium klorida dan 5 ml asam klorida ke dalam labu ukur 100 ml. Encerkan sampai tanda tera dengan air deionisasi.

Prosedur

Perhitungan

Dengan menggunakan kurva kalibrasi, hitung konsentrasi elemen logam dalam larutan:

$Konsentrasi Elemen (C) = \frac{(As - b)}{(m)} x 100\%$

dimana
C = konsentrasi elemen dari larutan sampel (μg/ml)
A = Nilai absorbansi larutan sampel
b = intersep y dari garis regresi
m = kemiringan / slope garis regresi.

Kandungan elemen sampel dalam mg/kg dengan mempertimbangkan langkah pengenceran dihitung sebagai:

$Kadar Elemen = \frac{(C x v x F)}{(w)}$

di mana
v = volume larutan sampel (ml)
F = faktor pengenceran
w = berat sampel (g).

Hasilnya dinyatakan dalam miligram elemen logam per kilogram sampel (mg/kg atau ppm), dan untuk elemen makro dalam gram per kilogram (g/kg).

Hal-hal yang perlu diperhatikan

1. Buffer ionisasi lantanum harus ditambahkan ke setiap sampel. Keberadaannya bisa terdeteksi oleh nyala hijau selama analisis. Hasil yang rendah akan dihasilkan jika buffer ionisasi tidak diberikan.
2. Selama langkah pemanasan asam klorida, beberapa larutan tiba-tiba berubah penampilan (warna, bentuk partikel), membentuk senyawa yang kurang larut. Jika terjadi demikian, lebih baik dilakukan mengulang analisis sampel baru dan berhenti pemansan pada saat asam klorida mulai berasap.

Acuan / Daftar Pustaka

AOAC 968.08. 2000. Minerals in animal feed and pet food, atomic absorption spectrophotometric method. Gaithersburg, MD, USA. AOAC 965.09. 2000. Nutrients (minor) in fertilizers, atomic absorption spectrophotometric method. Gaithersburg, MD, USA. Commission Regulation (EC) No 152/2009. 27 Jan 2009. Laying down the methods of sampling and analysis for the official control of feed. Annex IV, C, Official Journal of the European Union L54/1 from 26/02/2009. ISO 6869. 2000. Animal feeding stuffs – Determination of the contents of calcium, copper, iron, magnesium, manganese, potassium, sodium and zinc – Method using atomic absorption spectrometry. Geneva, Switzerland.

Fosfor / Phosphor - Metode Spektrofotometri

Prinsip Pengujian

Bahan pakan diabukan lalu dilarutkan dalam asam klorida. Pereaksi molibdovanadate ditambahkan bereaksi dengan fosfor yang menghasilkan warna kuning khas yang kemudian diukur secara spektrofotometri.

Cakupan Pengujian

Metode ini dapat diterapkan pada bahan pakan ternak dengan kandungan fosfor <50 g/kg. Untuk sampel dengan kandungan fosfor yang lebih tinggi, disarankan menggunakan metode gravimetri, yaitu quinoline fosfomolibdat.

Peralatan

1. Neraca analitik, ketelitian hingga 0,1 mg.
2. Cawan keramik untuk pengabuan.
3. Tanur, yang mampu mempertahankan suhu 600 ± 20˚C.
4. Hot Plate.
5. Spektrofotometer UV-VIS.

Reagen

1. Asam klorida 6 M.
2. Asam nitrat 14 M.
3. Larutan amonium heptamolibdat Larutkan 100 g amonium heptamolibdat tetra hidrat [(NH4) 6Mo7O24.4H2O] dalam air suling panas. Tambahkan 10 ml amonia (NH4OH: 14 M; ρ (NH4OH) = 0,91 g/ml) dan encerkan hingga 1 liter dengan air suling.
4. Larutan amonium monovanadat Larutkan 2,35 g amonium monovanadat (NH4VO3) dalam 400 ml air suling panas air. Aduk terus, tambahkan 7 ml asam nitrat (5.2) secara perlahan dan encerkan hingga 1 liter dengan air suling.
5. Pereaksi molibdovanadat Dalam labu ukur 1 L, campurkan 200 ml larutan amonium heptamolibdat, 200 ml larutan amonium monovanadat dan 135 ml asam nitrat. Encerkan sampai tanda dengan air suling. Saring jika terdapat partikel yang tidak larut.
6. Larutan standard fosfor (1 mg/ml) Dalam labu ukur 1 L, larutkan 4,394 g kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4) yang sebelumnya telah dikeringkan pada suhu 103 ± 2 °C selama 1 jam. Encerkan sampai tanda dengan air suling.
7. Kurva kalibrasi. Encerkan larutan standar fosfor hingga konsentrasi 2, 4, 6, 8 dan 10 μg/ml.

Prosedur

1. Persiapan sampel

• Timbang kira-kira 12 g hingga 0,2 mg (W) terdekat dalam cawan keramik dan tempatkan dalam tanur.
• Tutup tanur dan naikkan suhu secara bertahap hingga 600 °C selama kurang lebih 90 menit. kemudian buka tanur dan biarkan dingin
• Tambahkan 10 ml asam klorida 6 M ke dalam setiap cawan keramik dan letakkan di atas piring panas (sekitar 250 ° C), dan lumat selama 20 menit.
• Biarkan gelas kimia mendingin dan keluarkan dari hot plate.
• Pindahkan isi gelas kimia secara kuantitatif ke dalam labu ukur 250 ml, buat sampai tanda dengan air suling, lalu aduk

2. Mengukur kandungan fosfor

• Encerkan alikuot larutan dengan air suling untuk mendapatkan fosfor tidak melebihi 40 μg/ml.
• Pindahkan masing-masing 10 ml larutan encer dan larutan standar ke dalam labu takar terpisah. Ambil labu takar dengan 10 ml air. Ke setiap labu tambahkan 10 ml reagen molibdovanadat. Campur dan biarkan selama 10 menit.
• Ukur absorbansi larutan pada 430 nm dalam menggunakan spektrofotometer terhadap blangko.

Perhitungan

Hitung kandungan fosfor dalam larutan yang diukur dengan regresi linier.

Persentase fosfor dihitung sebagai:

$Kadar Fosfor (\%) = \frac{(C x V x F)}{(W x 10)} x 100\%$

dimana
C = konsentrasi fosfor dalam larutan yang diukur (mg/liter)
V = volume larutan (dalam liter)
F = faktor pengenceran
W = berat sampel (g)
10 = faktor untuk mengkonversi g/kg menjadi %.

Hal-hal yang perlu diperhatikan

1. Metode pelumatan lain dapat digunakan asalkan metode tersebut telah terbuktimemberikan hasil yang serupa (misalnya penggunaan asam yang berbeda atau pelumatan dengan microwave).

Acuan / Daftar Pustaka

Commission Regulation (EC) No 152/2009. 27 Jan 2009. Laying down the methods of sampling and analysis for the official control of feed. Annex III, P, Official Journal of the European Union L54/1 from 26/02/2009.
ISO 6491. 1998. Animal feeding stuffs – Determination of phosphorus content – Spectrometric method. Geneva, Switzerland.